DSpace collection: 學位論文

利用黃酮衍生物的結構與活性關係來保護UVB誘導傷害

Thu, 16 Jun 2011 13:57:24 GMT

title: 利用黃酮衍生物的結構與活性關係來保護UVB誘導傷害 abstract: 本論文利用斑馬魚進行活體毒性及抗氧化能力測試，作為篩選黃酮衍生物防護UVB能力的平台。首先，以100 mJ/cm2的UVB照射三天大的斑馬魚幼魚，每半小時照射一次共六次，發現最易觀察鰭傷害的變化是腹鰭。再加入一系列黃酮衍生物預防UVB所造成的傷害，以生物存活統計分析其毒性，並以抗氧化能力測試比較其防護UVB的能力，發現morin跟chrysin具有良好防護UVB的效果。進一步藉由理論與實驗結合的藥物開發方法—定量結構活性關係（Quantitative Structure-Activity Relationship. QSAR）分析，分別建立黃酮衍生物的毒性模型及抗氧化性模型，驗證QSAR模型分析與斑馬魚活體實驗的結果相符，並推測出黃酮衍生物在3’與4’位置的取代基若為氨基則具有良好的抗氧化能力。本研究結果顯示，結合斑馬魚活體實驗與QSAR分析，可提供快速篩選及推測驗證新化合物毒性及防護UVB能力的平台。
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斑馬魚細胞核因子C次單元在胚胎早期的功能分析

Thu, 16 Jun 2011 13:57:16 GMT

title: 斑馬魚細胞核因子C次單元在胚胎早期的功能分析 abstract: NF-Y 是 CCAAT 主要的結合轉錄因子，由 NF-YA、NF-YB、NF-YC 三種次單元所組成。本研究利用斑馬魚作為模式物種，來探討 nfyc 是否會影響眼睛的發育。首先選殖出斑馬魚的 nfyc 基因，發現 nfyc 在斑馬魚存在有兩種型態：nfyc-tv1 (336 個胺基酸) 及 nfyc-tv2 (360 個胺基酸)；斑馬魚的 nfyc-tv1 與人類、大鼠、小鼠、雞、牛、爪蟾序列相似度分別為 84%-87%；斑馬魚的 nfyc-tv2 序列相似度則分別為 79%-81%。利用原位雜合反應觀察 nfyc 在斑馬魚胚胎的表現，發現受精後 24 小時 nfyc 表現集中在腦部、眼睛及神經管上。以三天大的斑馬魚進行抗體染色實驗，發現 NF-YC 表現在初級頭竇 (primary head sinus)、心臟及體間血管上。接著顯微注射反股寡核苷酸 (morpholino) 抑制內生性 nfyc 的蛋白轉譯後，測量斑馬魚的單眼大小，發現抑制 nfyc 會造成斑馬魚眼睛 (301±6 μm) 縮小約為野生型斑馬魚眼睛大小 (139±45 μm) 的 46%。再利用基因轉殖魚 Tg(Nav1.6:GFP) 進行 Zn8 和 Zn12 抗體染色，發現抑制 nfyc 會影響神經節細胞層、內叢層、外叢層的表現。而抑制 nfyc 後進行phospho -histone H3 (PH3) 抗體染色及 TUNEL assay，結果顯示抑制 nfyc 會導致眼睛及心臟的細胞增生數量減少，且在腦部及眼睛有細胞凋亡的現象。進一步以 retinal homeobox 1 (rx1) 和 cone-rod homeobox (crx) 的探針進行原位雜合反應，發現抑制 nfyc 後的 crx 表現量降低，而 rx1 表現量則上升，可能是分化無法完全所導致。另外利用血管標記綠螢光及紅血球標記紅螢光之基因轉殖魚 Tg(fli1:EGFP)×Tg(gata1:RFP)，發現抑制 nfyc 後的體間血管有受損及血球流速變慢。綜合以上實驗結果，推測 nfyc 可能透過影響斑馬魚視神經及血管的發育，進而對視網膜的分化造成影響。
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Rrrm2在斑馬魚皮膚癌化過程中所扮演之角色

Thu, 23 Sep 2010 08:10:38 GMT

title: Rrrm2在斑馬魚皮膚癌化過程中所扮演之角色 abstract: 根據先前研究得知，在許多腫瘤細胞內shh訊號傳遞途徑會不斷被活化，進而造成細胞癌化而導致癌症的發生。其中基底細胞皮膚癌，basal cell carcinoma (BCC)，就是因為 shh 訊號傳遞途徑發生問題所造成。我們於先前發表的paper中，發現當斑馬魚轉殖品系Tg（K18:shh-RFP）體內Shh過度表現時，會導致皮膚產生癌化現象，之後取其胚胎進行基因晶片（microarray）分析，發現魚體內rrm2基因表現量大幅上升（Chen et al.,2009），因此可知在shh過度表現情形下，會使rrm2被過度活化。在建立另一斑馬魚轉殖品系Tg（K18:rrm2-RFP）過程中，發現部分注射過此質體之魚體於4天大時觀察到頭部、眼睛、胸鰭基部的皮膚發生變異，與野生品系相互比較之後發現此表現型疑似Tg（K18:shh-RFP），則初步懷疑shh與rrm2兩者間可能具關聯性；之後進行相關實驗觀察這些變異的皮膚組織是否與野生品系有不同之處。同時進行胚胎原位雜交反應（whole-mount in situ hybridization）確認rrm2在各個時期表現的訊號位置，結果發現訊號會表現在與細胞週期及細胞增生相關的位置上。為更進一步研究rrm2與shh間的關聯性，將設計實驗推敲及證明兩基因間關係。取野生品系斑馬魚胚胎在發育約5.5小時時，分別浸泡不同濃度的cyclopamine用以抑制shh之功能，以及利用顯微注射（microinjection）技術將過量的K18-shh-RFP質體注射於胚胎內使魚體內shh過度表現，皆收取4天大之樣本，利用胚胎原位雜交反應觀察rrm2的訊號表現，是否會因為shh被抑制或過度活化而明顯降低或增加。假使shh的基因表現與否會影響rrm2訊號表現，將試著搜尋rrm2上下游序列中是否具有Gli結合位，結果發現其上游有疑似Gli結合位的序列，則推測rrm2可能為shh所調控。過度表現的Shh會使rrm2表現增加，使細胞過度增生而可能導致皮膚表皮細胞癌化，本論文將探討rrm2與shh間關係且其在斑馬魚皮膚癌化過程中所扮演之角色。
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篩選具防護馬兜鈴酸腎病之天然物

Thu, 23 Sep 2010 08:10:35 GMT

title: 篩選具防護馬兜鈴酸腎病之天然物 abstract: 馬兜鈴酸（Aristolochic acid）是馬兜鈴科植物中特有的成分，過去研究顯示含馬兜鈴酸的中草藥會引發人體腎臟病變，但相關毒理研究多著重於成體毒性之探討。由於馬兜鈴酸的胚胎毒性及毒理機制目前仍不清楚，本研究以斑馬魚胚胎來探討馬兜鈴酸對胚胎發育之影響。首先，我們以馬兜鈴酸（10 ppm）浸泡處理24 hpf的斑馬魚胚胎7小時，發現馬兜鈴酸對48 hpf的胚胎腎臟（原腎小管、原腎輸送管及主要影響部位為腎絲球）及心臟（構型異常、心包腔腫大和卵黃下方積血）皆造成嚴重損傷，且72 hpf的胚胎存活率僅剩下14.2%。進一步觀測斑馬魚胚胎之腎絲球過濾率，發現浸泡馬兜鈴酸3小時後之斑馬魚腎功能剩下71.5±18.8%，而浸泡5小時後之腎功能僅有39.4±15.9%，表示馬兜鈴酸造成原腎損傷而導致腎臟功能喪失及存活率下降。此外，分析細胞死亡情形，馬兜鈴酸處理後會導致細胞凋亡（apoptosis）情況。觀察紅血球與白血球表現量，發現馬兜鈴酸處理後48hpf之斑馬魚，紅血球靜止不動及堆積在腎管及腸道附近，且紅、白血球數明顯變少。以 real-time PCR 分析馬兜鈴酸所引起之發炎反應，發現馬兜鈴酸會誘導 TNF-α、cox2及mpo 這些與發炎相關之基因表現量上升。在浸泡馬兜鈴酸之前以白藜蘆醇或熊果酸處理12小時，可抑制馬兜鈴酸所引發之發炎反應而減緩腎臟衰竭，但無法完全修復馬兜鈴酸造成的腎臟損傷。綜上所述，馬兜鈴酸毒性之細胞與分子機制可能是經由引發發炎反應造成腎臟損傷，引起造血功能異常，進而導致心臟及腎臟嚴重損傷，以致腎功能喪失，最終導致腎衰竭。
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砷對斑馬魚的毒性代謝效應：利用NMR光譜研究體內代謝過程

Thu, 23 Sep 2010 08:10:32 GMT

title: 砷對斑馬魚的毒性代謝效應：利用NMR光譜研究體內代謝過程 abstract: 砷(Arsenic，As)是以化合物型態普遍存在於自然界中的類金屬物質。無論是自然或人為因素來源，在台灣曾多次引起公共衛生問題。生物體在攝入砷以後會導致生理機能上的異常，極低濃度下促使細胞增生，高濃度下抑制生物代謝並引發多重器官病變。一般而言無機砷毒性遠大於有機砷，攝入無機砷後的解毒路徑是經由甲基化作用轉化成有機砷代謝出體外。本論文的實驗以斑馬魚作為生物模式(animal model)，以溶劑萃取代謝物並冷凍乾燥後，利用NMR為分析工具，判定並定量各代謝物質。觀察給予不同砷環境下，對斑馬魚代謝上的探討。實驗發現斑馬魚因砷而增強甲基化代謝能力，且TMAO能作為斑馬魚健康狀況的指標性代謝物，並証實斑馬魚與NMR的組合能提供研究代謝變化的可行方式。
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第一部分: 利用斑馬魚評估對乙醯基氨氛造成之腎毒性; 第二部分: Capsulin 在斑馬魚胚胎原腎發育中扮演的角色

Thu, 23 Sep 2010 08:10:30 GMT

title: 第一部分: 利用斑馬魚評估對乙醯基氨氛造成之腎毒性; 第二部分: Capsulin 在斑馬魚胚胎原腎發育中扮演的角色 abstract: 利用腎臟細胞表現綠螢光的基因轉殖斑馬魚Tg(wt1b:GFP)可以活體觀察腎臟發育的優勢，將其做為模式物種，觀察對乙醯氨基苯酚造成腎毒性及抑制Capsulin 基因對於腎臟發育的影響。第一部分:對乙醯氨基苯酚是近年來常用的退熱和止痛藥物。過量使用對乙醯氨基苯酚會造成哺乳類動物的肝腎損傷，但是其毒性對於胚胎發育卻所知甚少。浸泡不同的對乙醯氨基苯酚濃度(2.25,22.5,45mM)、時間(12, 24, 36, 48, 60 小時)和起始點(12, 24, 36, 48,60hpf)，將腎臟變異的結果分為三種類型: (1)沒影響；(2)中度缺失:原腎管和原腎腎小管彎曲弧度變異及空洞化，原腎絲球腫大或委縮但在正常位置；(3) 嚴重缺失:除和中度缺失相似外，原腎絲球還依中線分開。結果發現對乙醯氨基苯酚毒性造成的存活率或腎臟變異率，都受到濃度、浸泡時間及起始點的影響。根據多種腎臟部位抗體染色切片及定量PCR 結果發現，對乙醯氨基苯酚是引發細胞凋亡而造成腎毒性。再利用wt1b 探針對浸泡對乙醯氨基苯酚的胚胎做全胚胎原位雜交，發現會造成wt1b 訊號減少及不在正常位置表現。第二部分:Capsulin 為具有basic helix I-loop-helix II(bHLH)結構之轉錄因子。為了深入研究capsulin 如何參與腎臟的發育，首先進行胚胎原位雜交確定 capsulin 在斑馬魚各時期其表現部位(20,24,31,36,42,48,54hpf)，與wt1b 切片(31,48hpf)對照結果發現其沒有表現在腎絲球。再利用capsulin 抗體染色發現注射capsulin MO 會造成原有心臟、原腎管、頭部背側後方表現訊號消失或變形。接著用腎臟細胞會表現綠螢光的基因轉殖斑馬魚，發現注射capsulin MO 劑量越高造成的腎臟變異率越高及存活率下降越嚴重。腎功能分析結果也印證注capsulin MO 會造成其功能下降。根據多種腎臟部位抗體染色切片結果顯示注射capsulin MO 造成腎臟部位細胞數量減少及排列不緊密。再利用早期原腎中胚層wt1b 及wt1a 探針對野生種及capsulin MO 後斑馬魚做全胚胎原位雜核，抑制Capsulin 會造成兩者訊號減少及不在正常位置表現。
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含澱粉酶菌(Exiguobacterium sp.)的分離、鑑定與特性分析

Thu, 23 Sep 2010 08:10:28 GMT

title: 含澱粉酶菌(Exiguobacterium sp.)的分離、鑑定與特性分析 abstract: α-澱粉酶家族擁有三項共同特徵：在α-糖甘鍵上作用、擁有包含催化端的花籃狀蛋白結構、基因上有4個高度保留區分別和形成催化端與穩定花籃狀蛋白構形有關。本實驗利用基因轉殖方法，嘗試轉殖α-澱粉酶基因片段，透過隨機水解細菌染色體、轉殖入宿主細胞，製做Exiguobacterium sp.的基因圖譜，並以活性染色方式篩選菌株。成功轉殖的片段再經過修飾後轉殖入表達載體，配和表達宿主經過1 mM IPTG誘導後，透過蛋白質膠體染色可看出酵素明顯活性增加。原菌酵素活性測試為48.82 U/mg，酵素最適pH為6，最適反應溫度為37℃。
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啤酒酵母菌JHD1p去甲基酶之選殖及專一性探討

Thu, 23 Sep 2010 08:10:25 GMT

title: 啤酒酵母菌JHD1p去甲基酶之選殖及專一性探討 abstract: 染色體的基本組成單元是由H2A、H2B、H3、H4各二分子所組成的核心組蛋白纏繞著146 鹼基對DNA而成。核心組蛋白的共價修飾藉由貢獻額外的遺傳訊息來調節基因組的功能。現階段，組蛋白常見的共價修飾之一是甲基化。近年來，確定甲基化是具有可逆性的，因此發現了另一種機動性組蛋白共價修飾，即去甲基化。所以，組蛋白的共價修飾在基因表現的遺傳控制上扮演一個極關鍵的角色。本研究探討啤酒酵母菌去甲基酶JHD1p的受質專一性研究，基於報導在酵母菌的胞外去甲基酶JHD1p為具活性的酵素，而且大部份研究都以組蛋白上的受質為主要研究目標，所以本實驗想利用啤酒酵母菌去甲基酶JHD1p的胞外活性測試，尋找是否還有非組蛋白的功能性受質存在。
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Pseudomonas taiwanensis TKU015殺蟲蛋白之基因選殖與特性研究

Thu, 23 Sep 2010 08:10:22 GMT

title: Pseudomonas taiwanensis TKU015殺蟲蛋白之基因選殖與特性研究 abstract: 殺蟲劑具有提高農業生產量、降低食品價格並具有成本低廉、效果迅速的優點。但隨者時間改變昆蟲會逐漸產生抗藥性，此外，殺蟲劑對周遭環境及非目標生物也具有毒害，會危害人體健康。近期，生物性殺蟲劑逐漸成為新式殺蟲劑研究的方向。生物性殺蟲劑乃採用天然物質原料，例如動物、植物、微生物等。它擁有對週遭環境污染性小及針對目標害蟲具專一性的特點。現又以微生物所生產的毒殺蛋白殺蟲劑為市場大宗。 Pseudomonas taiwanensis TKU015為台灣篩選出的土壤菌，經由檢查其殺蟲蛋白之胺基酸序列發現和Pseudomonas entomphila L48之殺蟲蛋白具有極高的相似性，故設計引子選殖出其殺蟲蛋白基因作進一步的研究。用聚合酶連鎖反應擴增之片段有兩段，為先前已被選殖出來，大小為2 kb的活性片段，及運用Genome Walker TM擴增原序列基因C端片段所得全長3 kb片段。將殺蟲蛋白基因接合到pET-32 載體上，再轉形到大腸桿菌BL21宿主表達，在37度下以IPTG誘導搖瓶過夜，以表現目標蛋白。利用HisTag將目標蛋白進一步純化出來，再去除多餘的鹽類，最後將純化的重組蛋白對果蠅幼蟲做生物活性測試，並比較探討不同蛋白質長度片段之殺蟲活性的差異。
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過度表現ADH3p對啤酒酵母粒線體形態上的影響

Thu, 23 Sep 2010 08:10:15 GMT

title: 過度表現ADH3p對啤酒酵母粒線體形態上的影響 abstract: 本研究主要目的在於，過度表現ADH3p對啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)粒線體形態上的影響，我們先建構了含有正常ADH3序列的質體pYES2-ADH3跟點突變過的ADH3序列的質體pYES2-ADH3G211A ，將這兩個質體和不含ADH3序列的質體pYES2分別transform到啤酒酵母菌內，再使用半乳糖(galactose)誘導使ADH3p跟ADH3pG211A過度表現，將誘導後的菌體打破，取出所含的蛋白質用SDS-PAGE觀察誘導的狀況跟測定比活性，確定ADH3p和ADH3pG211A有被誘導出來，且ADH3pG211A的點突變有效之後，使用MitoTracker Green FM染色後，在螢光顯微鏡下觀察粒線體形態上的變化，我們發現當ADH3過度表現的時候，網狀的粒線體比例會下降，而分散呈點狀的粒線體比例上升；此外我們也使用FACS (Fluorescence-activated cell sorting)對染色之後的酵母菌所發出的螢光強度進行測量，結果發現有過度表現ADH3p的實驗組，螢光強度上升。
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Serratia marcescens TKU011生產靈菌紅素之條件與定性

Thu, 23 Sep 2010 08:10:07 GMT

title: Serratia marcescens TKU011生產靈菌紅素之條件與定性 abstract: Serratia marcescens TKU011 係一株以蝦頭殼粉末作為唯一碳/氮源之蛋白酶及幾丁聚醣酶生產菌。本研究發現以烏賊軟骨粉末（SPP）作為碳/氮源時具有可生產紅色色素-靈菌紅素（prodigiosin）的能力，菌株醱酵產生之紅色色素經分離純化後，藉由1H-NMR 及ESI-MS 確認合成之靈菌紅素屬於prodigiosin。TKU011 生產靈菌紅素之較適培養為含有 1.5%烏賊軟骨粉末、0.1% K2HPO4 及0.05% MgSO4〃7H2O 之50 mL 液態培養基（pH 7~9）於30℃振盪培養一天後接著移到25℃繼續培養兩天，靈菌紅素產量可達0.978 mg/mL。醱酵上清液經試驗推測亦含有脂胜肽類生物界面活性劑沙雷濕潤素（serrawettin），表面張力值隨著靈菌紅素的產量增加而降低。
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啤酒酵母菌SEE1p在大腸桿菌中的蛋白質表現,純化及甲基化活性

Thu, 23 Sep 2010 08:10:05 GMT

title: 啤酒酵母菌SEE1p在大腸桿菌中的蛋白質表現,純化及甲基化活性 abstract: 人類基因體計劃完成後，生命科學的研究慢慢從基因體學轉變到蛋白質體學的領域。蛋白質的修飾及轉錄調控成為兩個重要研究主題。蛋白質的甲基化在這兩部份佔了重要的地位，此為一種常見的轉譯後修飾行為，目前已知部分蛋白質甲基化扮演重要的細胞調控角色，然而大部分的蛋白質甲基化所產生的功能還所知有限，依然有許多蛋白質甲基化所需的轉移酶尚未找到。對於SEE1這段不確定的酵母菌開放讀碼框(open reading frame;ORF)，假定它能在細胞質裡轉錄出一個28 kDa大小的功能性蛋白質。再經由序列的比對，我們推測它是一株S-腺苷甲硫胺酸甲基轉移脢(S -adenosyl-L-methionine methyltransferase)。因此我們利用重組蛋白技術，將啤酒酵母菌中的SEE1基因構築到大腸桿菌(Escherichia coli ; E.coli)中並使其分別表現重組蛋白，並利用His-tag融合純化法純化出所需之重組蛋白，並以去除SEE1基因的啤酒酵母菌(簡稱ΔSEE1)為受質，以具有放射性的S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine）為輔基質來測定See1p重組蛋白之活性。並利用等電點聚焦電泳(Isoelectric Focusing electrophoresis ; IEF) 和十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis ; SDS–PAGE)方式分離可能受質後，以質譜儀定序出其可能受質產物。
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Burkholderia cepacia TKU025 生產酪胺酸酶抑制劑之條件及特性分析

Thu, 23 Sep 2010 08:10:03 GMT

title: Burkholderia cepacia TKU025 生產酪胺酸酶抑制劑之條件及特性分析 abstract: Burkholderia cepacia TKU025係以烏賊軟骨粉為唯一碳/氮源，篩選自台灣北部土壤之一株酪胺酸酶生產菌，經鑑定為Burkholderia cepacia，是一非葡萄糖發酵之革蘭氏陰性菌。B. cepacia TKU025生產酪胺酸酶抑制劑之較適培養條件為含有1.0 % 烏賊軟骨、0.1 % K2HPO4及0.05 % MgSO4．7H2O（pH7）之25 mL液態培養基於30 °C振盪培養4天。發酵上清液經乙酸乙酯去除脂溶成分、後續使用水層部分進行Sephacryl S-100以及薄膜層析法(thin layer chromatography)等步驟，進行抑制劑之分離純化。此抑制劑有非常良好之熱安定性及pH安定性，於100 °C及pH 2-12反應下，其活性均不受影響。此外，經由Sephacryl S-100層析，所得初步分離之抑制劑對E. coli 及B. cereus TKU006之生長具有顯著抑制活性，兩者抑制效果最高都達到95 %以上。
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Paenibacillus macerans TKU021發酵幾丁類物質所生產抗氧化物之特性研究

Thu, 23 Sep 2010 08:10:00 GMT

title: Paenibacillus macerans TKU021發酵幾丁類物質所生產抗氧化物之特性研究 abstract: Paneibacillus macerans TKU021係篩選自台灣北部土壤，能發酵烏賊軟骨生產抗氧化物質。本研究以烏賊軟骨作為唯一碳/氮源，調整添加濃度(0.5~2%)，於37℃培養0~6天，測定其發酵上清液之DPPH自由基清除率，發現以烏賊軟骨濃度2%，培養5天的發酵液有最佳的清除率。以此濃度為基準，而後進行了不同pH值的發酵上清液之DPPH自由基清除率測定。本研究亦對其抗氧化物質做了熱安定性以及酸鹼耐受性的實驗，發現其抗氧化物質有很好的熱安定性以及酸鹼耐受性。此外本研究也對Paneibacillus macerans TKU021的發酵上清液做了還原力以及總酚含量測試，同時也和本實驗室保存菌株Bacillus subtilis TKU004做了抗氧化力比較的實驗。
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Acinetobacter calcoaceticus TKU024所生產幾丁聚醣酶之特性分析與應用

Thu, 23 Sep 2010 08:09:58 GMT

title: Acinetobacter calcoaceticus TKU024所生產幾丁聚醣酶之特性分析與應用 abstract: TKU024，係以烏賊軟骨粉末為唯一碳/氮源，篩選自台灣中部土壤之一株幾丁聚醣酶生產菌，經鑑定為Acinetobacter calcoaceticus。TKU024 幾丁聚醣酶較適生產條件為1.5% 烏賊軟骨粉末、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4．7H2O之液態培養基(pH 8)於37℃振盪培養4 天。將發酵所得上清液離心，經硫酸銨沉澱、DEAE-Sepharose、Mcaro-Prap DEAE 及Phenyl Sepharose 管柱層析後，可純化出兩個幾丁聚醣酶(C1/C2)，經SDS-PAGE 測得分子量分別為27 kDa及66 kDa。經胜肽質譜鑑定，C1 分別與Cellvibrio japonicus Ueda107 之幾丁質酶(GenBank 編號為gi1192361966)、Pseudomonas aeruginosa PA01 之琥珀脫氫酶鐵硫亞基(GenBank 編號為gi115596781)相似，相似度分別為4%及10%；C2與 Arthrobacter sp. 之幾丁質酶(GenBank 編號為gi127065204)相似，相似度為7%。於最適反應pH、最適反應溫度、pH 安定性、熱安定性方面，C1為pH 6、50℃、pH 8-9 及<70℃，C2 為pH 7、60℃、pH 6 及<60℃。C1 活性受5 mM Cu2+、Zn2+、Mn2+及2% (v/v) SDS 抑制，且於4~5 mM Mn2+完全抑制；C2 活性受5 mM Ca2+、Urea、EDTA、Zn2+、Mn2+抑制，但在1 mM Mn2+則有少許促進效果，於2% (v/v) SDS、Triton X-100、Tween 20 和0.5% (v/v)Tween 20 有輕微抑制效果。
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Bacillus cereus TKU022所生產幾丁聚醣酶及蛋白酶之特性分析與應用

Thu, 23 Sep 2010 08:09:55 GMT

title: Bacillus cereus TKU022所生產幾丁聚醣酶及蛋白酶之特性分析與應用 abstract: Bacillus cereus TKU022係以蝦頭粉為主要碳/氮源，篩選自台灣北部土壤之幾丁聚醣酶生產菌，發酵蝦頭粉所得離心上清液具有幾丁聚醣酶及蛋白酶活性。幾丁聚醣酶較適生產條件為 1.5% 蝦頭粉、0.1% K2HPO4、0.05% MgSO4．7H2O 之50mL液態培養基（pH5）於 37℃振盪培養 2天。發酵所得離心上清液經硫酸銨沉澱、DEAE-Sepharose、Phenyl Sepharose 、Macro-Prep DEAE及Sephacryl S-100等層析步驟後，可純化出一種幾丁聚醣酶及一種蛋白酶，經 SDS-PAGE測定分子量分別為 44 kDa及45kDa。其幾丁聚醣酶及蛋白酶之最適反應pH、最適反應溫度、pH 安定性、熱安定性分別為 pH 7, 60 ℃, pH 7-10, <40 ℃及pH 10, 50-60℃, pH 6-10, <50 ℃；幾丁聚醣酶活性會受Cu2+及Mn2+所抑制，而非離子型界面活性劑 Triton X-100、Tween 20及離子型界面活性劑SDS 則不具抑制效果；蛋白酶則會受到Mn2+、EDTA及SDS所抑制，在2 mM之存在下Triton X-100、Tween 20、Tween 40還維持其原活性97 %、105 %及94 %。 TKU022以較適生產幾丁聚醣酶培養基（1.5 % SHP, 37 ℃, pH 5）培養8天，所得發酵上清液於第5天有最高之還原醣(649 µg/mL)產量；並0.05 %之還原醣添加至MRS broth中可提升Lactobacillus paracasei TKU010之生長速率。
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Paenibacillus sp. TKU023生產胞外多醣之條件及特性分析

Thu, 23 Sep 2010 08:09:52 GMT

title: Paenibacillus sp. TKU023生產胞外多醣之條件及特性分析 abstract: TKU023係以烏賊軟骨粉為唯一碳/氮源，篩選自台灣北部土壤之一株胞外多醣及生物界面活性劑生產菌，經鑑定為Paenibacillus sp.。TKU023生產胞外多醣之較適培養條件為含有1% 烏賊軟骨、0.1％ K2HPO4及0.05％ MgSO4．7H2O之50 mL液態培養基（pH 7.32）於37℃振盪培養5天。 TKU023發酵所得上清液經加熱（121℃、20 min）、脫色後可得粗胞外多醣（1.7631 g），再將粗胞外多醣利用Sevag reagent去蛋白、酵素水解、透析後，可將胞外多醣分解成寡醣類物質，利用核磁共振（NMR）光譜分析水解後之寡醣結構，發現其1H、13C譜與麥芽糖之1H、13C譜相似，可推測胞外多醣經酵素水解後可得部分麥芽糖之單體。此外以烏賊軟骨粉做為發酵碳/氮源，利用TKU023在不同培養體積下培養1～6天，發現培養體積50 mL在培養第5天所得發酵上清液具有較高的DPPH清除能力（77％）及較佳的總酚含量、還原力、螯合亞鐵離子能力。
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Bacillus licheniformis TKU004生產生物界面活性劑之條件與特性分析

Thu, 23 Sep 2010 08:09:49 GMT

title: Bacillus licheniformis TKU004生產生物界面活性劑之條件與特性分析 abstract: 本研究所篩選TKU004這株生物界面活性劑生產菌，經由16SrDNA序列比對及API試驗鑑定為Bacillus licheniformis 。 B. licheniformis TKU004 生產生物界面活性劑之較適培養條件為含有1%烏賊軟骨粉、0.1% K2HPO4 及0.05% MgSO4．7H2O之50 mL液態培養基 (pH 7)充填於250 mL 通氣錐形瓶並經滅菌20分鐘後，進行接菌並於37℃搖瓶(150 rpm)培養1天。所得醱酵上清液，經酸沈澱、乙酸乙酯萃取、甲醇萃取等步驟，進行生物界面活性劑之純化，其產量為0.551 g/L。TKU004生產之生物界面活性劑能降低水的表面張力至25.42 mN/m，乳化指數(E24)為70%，而且熱穩定性高，不會受高溫影響而失活。此生物界面活性劑之pH 安定性、鹽度安定性分別為pH>7、鹽濃度<2 %。此外，2 mg/mL之生物界面活性劑對Fusarium oxysporun生長具有40%抑制效果。
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3,3'-二吲哚甲烷在卵巢癌細胞之抗細胞增生作用

Thu, 23 Sep 2010 08:09:46 GMT

title: 3,3'-二吲哚甲烷在卵巢癌細胞之抗細胞增生作用 abstract: 過去的研究指出3,3''-二吲哚甲烷具有抗癌的效果。本實驗分析3,3''-二吲哚甲烷在不同HER2及p53蛋白質含量的卵巢癌細胞之抗細胞增生效果。這個研究發現，3,3''-二吲哚甲烷可能透過延滯細胞週期造成抑制卵巢癌細胞的生長。3,3''-二吲哚甲烷透過改變Cyclin dependent kinases inhibitors (p21, and/or p27)的蛋白質含量，抑制了MDAH-2774、SKOV-3及TOV-21G的增生。總結，這研究發現3,3''-二吲哚甲烷可能具有發展成化學預防和治療卵巢癌劑的能力。
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Burkholderia cepacia TKU026以烏賊軟骨粉為唯一碳/氮源發酵生產酪胺酸酶抑制劑之研究

Thu, 23 Sep 2010 08:09:44 GMT

title: Burkholderia cepacia TKU026以烏賊軟骨粉為唯一碳/氮源發酵生產酪胺酸酶抑制劑之研究 abstract: 本研究係以水產廢棄物為主要碳/氮源，經微生物發酵後其可生產酪胺酸酶抑制劑，並探討其較適培養條件為研究目的。使用菌株為Burkholderia cepacia TKU026，源自台灣北部土壤。以50mL液態培養基含1％烏賊軟骨粉（squid pen powder；SPP）、0.1％ K2HPO4及0.05％ MgSO4．7H2O於250mL三角錐瓶，置放37℃、150rpm震盪培養三天可得較高酪胺酸酶抑制劑活性（5000U/mL）。在抗菌實驗方面發現其發酵上清液在濃縮10倍及8倍時可有效抑制Aspergillus fumigatus及Fusarium oxysporum的生長。
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第一部分 : 斑馬魚VHL基因在腎臟發育時的生物活性 ; 第二部分 : 斑馬魚ATP2A家族在發育時的基因表現

Thu, 23 Sep 2010 08:09:42 GMT

title: 第一部分 : 斑馬魚VHL基因在腎臟發育時的生物活性 ; 第二部分 : 斑馬魚ATP2A家族在發育時的基因表現 abstract: 論文提要內容：第一部分： VHL基因為罕見遺傳疾病馮希爾．林島氏症候群(von Hippel-Lindau syndrome)之致病基因，當其發生基因突變或缺失時將導致VHL disease的發生。VHL蛋白主要作用為藉由氧氣調控，降解已和氧氣結合之缺氧誘導因子(Hypoxia-Inducible Factor)1α、2α，故可因此調節缺氧誘導相關的種種作用機制。VHL蛋白又可與轉錄延伸因子 (Elongin)B-C、CUL2 蛋白組成VBC複合物，通過抑制RNA聚合酶II的活性直接抑制基因轉錄。VHL蛋白具有175個胺基酸，其第10至第164的胺基酸為具tumor suppress功能的domain。為瞭解斑馬魚VHL與其他脊椎動物之親緣關係，於是利用BlastN、Clustal W演算法與其他物種進行蛋白質序列比對，結果得到斑馬魚與熱帶爪蟾、雞、人類、狗、大鼠與小鼠等各物種的相似程度分別為 43%、40%、45%、45%、43%與45%。親緣關係上人類、犬科與小鼠的關係較為接近；而斑馬魚和雞、熱帶爪蟾較為接近。　　VHL disease的患者約76%會有腎臟損傷、囊腫的發生，而主要的機制尚未明朗，為了深入研究VHL如何對腎臟發育造成影響，我們選用斑馬魚作為材料，首先，我們利用野生種(wild type)、Tg(WTIb:EGFP)及Tg(gata-1:RFP)的斑馬魚以進行顯微注射VHL morpholino antisense oligonucleotide(VHL_MO)的方式阻斷VHL的轉譯，進而使內生性VHL蛋白的量下降，配合α6F抗體染色與螢光顯微鏡進行觀察，可觀察得到腎絲球有變形、囊腫等情形發生，腎小管角度發生異常且顯得較鬆散，也常有腎臟發育延遲之情形發生。故可證實當VHL蛋白的量下降時，會對於腎臟造成傷害甚至囊腫。接著，蒐集未接受及已接受VHL-MO注射之各時期的斑馬魚胚胎，進行Fli-1的原位雜交實驗。Fli-1主要表現於血管內皮細胞，可用於觀察血管新生的情形。實驗結果發現，當胚胎接受VHL-MO注射後，不論各個時期其Fli-1的表現均明顯高於未注射VHL-MO之胚胎(WT)。爲更加明確了解訊號表現的差異程度與內部情形，接著將搭配ZO-1、DAPI染色法、鹼性磷酸酶染色法(alkaline phosphatase stain)以及冷凍組織切片處理技術。觀察結果發現，接受VHL_MO注射後之胚胎內部血管新生確實更強烈，且有血管過度生長亂長的情形，腎贓細胞也很完整而無破裂等情形發生。這些實驗結果顯示接受VHL_MO注射後的胚胎，其血管新生更旺盛，發生血管新生的區域也更多，可能因此促使腎臟不正常發育而造成囊腫或變形。第二部分：　　ATP2A family在生物體內的主要功能為產生各種SERCA Ca2+-ATPases用以水解ATP並調控Ca2+的流動。ATP2A1會產生一種SERCA Ca2+-ATPases，可水解ATP並調控Ca2+由胞質流向肌肉漿質網內並刺激肌肉的收縮。ATP2A2a會產生另一種SERCA Ca Ca2+-ATPases，主要可刺激心肌收縮並調節心肌將Ca2+的泵出泵入。　　為瞭解斑馬魚ATP2A family與其他脊椎動物之親緣關係，於是利用BlastN、Clustal W演算法與其他物種進行蛋白質序列比對。.在ATP2A1的方面，斑馬魚之ATP2A1胺基酸序列與非洲爪蟾、雞、人類、狗、大鼠與小鼠等各物種的相似程度分別為87%、88%、87%、87%、87%與87%。親緣關係上人類、犬科與小鼠的關係較為接近；而斑馬魚和雞、非洲爪蟾較為接近。在ATP2A2a的方面，斑馬魚ATP2A2a之胺基酸序列與非洲爪蟾、雞、人類、狗、大鼠與小鼠等各物種的相似程度同樣分別為87%、88%、87%、87%、87%與87%。親緣關係上人類、犬科與小鼠的關係較為接近；而斑馬魚和雞、非洲爪蟾較為接近。由於兩者在各物種間皆有高達87%以上的序列相似性，顯示出ATP2A family在各個物種間具有相當高度的重要性與保守性。　　接著，為了瞭解ATP2A family在斑馬魚mRNA層次上的表現，於是利用斑馬魚的ATP2A1、ATP2A2a mRNA探針進行胚胎原位雜交實驗(whole-mount in situ hybridyzation)實驗，藉此以觀察ATP2A family之時空分佈，並偵測各時期斑馬魚胚胎中ATP2A family mRNA的表現。在ATP2A1方面，於1cell就有看到訊號出現，6小時時期形成胚盾(shield)時訊號充滿胚盾，12小時時期訊號充滿魚體全身，18小時時期訊號表現在18-somite上；於受精後24小時時期及31小時時期訊號表現在身體肌肉細胞上；48小時時期以後訊號表現在眼睛附近部分肌肉、下顎肌肉與身體軀幹肌肉細胞上；經由冷凍切片觀察，第3、4天可明顯看到除臉部、下顎與軀幹肌肉細胞外，在腸道內也有訊號的表現；受精5天至7天訊號表現則開始逐漸下降。　　在ATP2A2a方面，一樣於1cell就有看到訊號出現；受精後6小時、12小時與18小時時期魚體兩側接近卵黃的中胚層區域有訊號產生，且18小時時期在心臟前趨細胞(cardiac precursors )有明顯之訊號；在受精後24、31及48小時時期訊號表現在心臟與身體軀幹的肌肉細胞上，48小時時期下顎肌肉亦有訊號表現；在受精後3天至6天時期訊號表現在眼睛周圍、心臟和下顎部分肌肉上，身體肌肉上的訊號開始少了很多，只剩靠近頭部的部分訊號比較強烈。
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Notch訊息在乳腺癌的表現

Thu, 23 Sep 2010 08:09:40 GMT

title: Notch訊息在乳腺癌的表現 abstract: 乳腺癌為全世界女性發生率最高的癌症，每年有一百一十五萬新增病例，佔全世界每年癌症人數一千一百萬的百分之十。近年來，台灣每年也有將近六千名新增的乳腺癌病例，且發病年齡有年輕化之趨勢，好發年齡高峰期在四十五至五十五歲之間，與西方歐美國家相較年輕十歲。由於乳腺癌須依賴乳房超音波、乳房磁振掃描、傳統的病理組織學，作為篩檢、診斷及治療的預後相關因子外，尚需輔以生物腫瘤標記作為參考。基於以上所述特性，針對台灣婦女乳腺癌的研究，成為一個重要的課題。近幾年的文獻提到乳腺癌表現因子除了雌激素接受體(ER)、黃體激素接受體(PR)及腫瘤蛋白Her-2/neu和預後有相關以外，乳腺癌發生機轉也與生物發育中佔極重要角色的Notch signal pathway有關，其中Notch family接受體Notch1和與其結合之受質Jagged1、Delta之表現和腫瘤蛋白HER-2/neu之表現有關聯，因此我們想更進一步分析Notch1、Jagged1、Delta三者之相對表現差異。本研究利用組織微陣列工具，針對兩類型乳腺癌來建立組織晶片。而此兩類型區分，以病理報告中的乳腺癌表現因子ER/PR及腫瘤蛋白HER-2/neu陽性或陰性來區分，分為ER/PR陰性和HER-2/neu陽性，以及ER/PR陽性而HER-2/neu陰性兩大類，再以取出癌症組織建立組織晶片。利用所建立乳腺癌組織晶片，以Notch1、Jagged1、Delta之抗體進行免疫組織化學染色，所得之結果利用卡方檢定及Spearman等級相關係數檢定，統計分析。其結果呈現在59案例中，HER-2/neu的表現與組織惡性度有正相關性。而Notch1的表現量和組織惡性度呈現負相關性。Jagged1在乳腺癌組織的表現和Notch1相似。但Delta表現量則與Jagged1的表現呈現負相關。最後，Jagged1的表現與組織惡性度呈現負相關性。但是在HER-2/neu陰性條件下，Jagged1的表現與組織惡性度呈現正相關性。關鍵字：雌激素接受體、黃體激素接受體、腫瘤蛋白HER-2/neu、卡方檢定、組織微陣列、組織惡性度
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芋頭α-半乳糖水解酶基因的轉殖與表現

Thu, 23 Sep 2010 08:09:35 GMT

title: 芋頭α-半乳糖水解酶基因的轉殖與表現 abstract: α-半乳糖水解酶（α-galactosidase）是一種可以將末端半乳糖水解的酵素，在各種生物體中都存在，並且擁有許多不同的生物功能，例如在植物中α-半乳糖水解酶參與醣類的代謝和運輸（source to sink transport）。在應用方面，α-半乳糖水解酶可以使B型紅血球表面抗原上的半乳糖水解而變成O型紅血球，因此藉由基因工程的方法取得基因並利用 Pichia pastoris 的蛋白質表現系統來產生大量的芋頭 α-半乳糖水解酶以進行血行轉換的測試和應用。由每公斤的芋的塊莖中進行萃取可獲得約 83.3 Unit 的 α-半乳糖水解酶酵素活性，接著進行三次的管柱層析步驟使蛋白質純化 6019 倍，並使樣品最終純化至單一蛋白質片段，最後樣品的比活性為 54.18 Unit/mg。接著將片段送去進行蛋白質 N 端序列的鑑定和蛋白質中間部分片段序列的鑑定，並利用鑑定的序列和 GH27 family α-半乳糖水解酶的高度保留序列設計 degenerate primer dFP IA 和 dRP 2A 來夾出第一段的基因序列；利用已知的基因序列設計 forward 和 reverse gene specific primer 並經過數次的 PCR 之後夾出完整的基因序列，芋頭 α-半乳糖水解酶的基因由 1082 個 base 所組成，在經過轉譯後其蛋白質分子量為 40.01 kDa。最後將芋頭 α-半乳糖水解酶的基因接入 pPIC9k 質體中，並轉殖至 Pichia pastoris（GS115、SMD1168）中進行基因的誘導與表現。在 Pichia pastoris 中誘導基因表現六天後，GS115 和 SMD1168 的細胞內酵素活性最多分別為 0.5 和 0.45 Unit/mL，而分泌至細胞外的酵素活性則只有胞內的 1/10。
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探討大豆苷原在神經膠原致癌基因過度表現的人類卵巢癌細胞之效應

Sun, 10 Jan 2010 18:31:46 GMT

title: 探討大豆苷原在神經膠原致癌基因過度表現的人類卵巢癌細胞之效應 abstract: 過去研究顯示葛根內一種異黃酮類的大豆苷原(Daidzein)可有效抑制大腸癌、子宮頸癌、胰臟癌以及乳癌的生長。而人類上皮生長因子接受體第2蛋白 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 protein, p185HER2/neu ) 在許多癌症中發現有過度表現的現象。本研究發現Daidzein 在p185HER2/neu 過度表現的卵巢癌SKOV3細胞中不僅可抑制細胞的增生，並且可抑制p185HER2/neu 的蛋白質表現。本文發現大豆苷原可藉由在轉錄層面上抑制p185HER2/neu 的蛋白質表現；此外，本研究亦發現在高濃度的大豆苷原下加入SKOV3 細胞後能夠減弱由p185HER2/neu 調控的細胞位移以及轉移的可能性。因此本研究證實大豆苷原能夠抑制神經膠原致癌基因過度表現的人類卵巢癌SKOV3細胞的增生與移動性。
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酵母菌醛類去氫酶4之選殖、異源表現、純化及其動力學分析

Sun, 10 Jan 2010 18:31:43 GMT

title: 酵母菌醛類去氫酶4之選殖、異源表現、純化及其動力學分析 abstract: 酵母菌醛類去氫酶4（YOR374w）是一種位在粒線體內的去氫酶，需要鉀離子的活化，以及NAD+或NADP+當輔酶，在乙醇的代謝途徑扮演很重要的角色，尤其是以乙醇當碳源的環境下。為了了解醛類去氫酶對於其他不同代謝途徑是否有影響，經由選殖出正確ALD4基因，再利用大腸桿菌大量的表現出ald4p，透過管柱層析純化之後，對許多不同的受質做活性分析。在酵母菌的泛酸生合成途徑中，3-aminopropanal氧化成beta-alanine是重要的一個反應，而glycine betaine是一種滲透壓保護劑，對於細菌在高滲透壓環境下的生存很重要，是由choline氧化成betaine aldehyde再氧化生成glycine betaine，我們主要想了解ald4p對這兩種醛類3-aminopropanal和glycine betaine aldehyde是否有活性，希望能加以應用和建構出泛酸和glycine betaine更完整的代謝途徑。另外在蛋白質表現的過程中，我們利用lactose來誘導表現，比較以lactose誘導與IPTG誘導之最適條件，結果不論在單位菌數蛋白質的表現量和活性都是差不多的，但是lactose可獲得更多的菌數。在考量成本下，lactose會比IPTG佳。
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3,3'-二吲哚甲烷抑制神經膠原致癌基因表現和轉移特性之研究

Sun, 10 Jan 2010 18:31:39 GMT

title: 3,3'-二吲哚甲烷抑制神經膠原致癌基因表現和轉移特性之研究 abstract: 在人類乳癌和其它的癌症病患中約有 30~40% 肇因於神經膠原致癌基因大放大或過度表現。3,3''-二吲哚甲烷 (DIM) 為吲哚三甲醇 (I3C) 在酸性條件下所形成的雙聚體，和 I3C 比起來，DIM 具有較穩定且較好的抗癌效果。從最近的文獻得之 3,3''-二吲哚甲烷對於不同的癌細胞有抗增生和促進細胞凋亡的功能。在本研究中，我們首先證實 3,3''-二吲哚甲烷可抑制神經膠原致癌基因的表現。再者，更發現 3,3''-二吲哚甲烷對於神經膠原致癌基因過度表現的癌細胞，不僅能有效抑制癌細胞的存活率及降低內生性p185HER2/neu的表現，也可抑制因神經膠原致癌基因所引發的細胞癌變和轉移能力。這些結果證實3,3''-二吲哚甲烷可做為對抗神經膠原致癌基因的標靶抗癌藥物。關鍵字：神經膠原致癌基因、3,3''-二吲哚甲烷、轉移
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黃芩素在神經膠原致癌基因過表現卵巢癌細胞中的抗癌效果

Sun, 10 Jan 2010 18:31:35 GMT

title: 黃芩素在神經膠原致癌基因過表現卵巢癌細胞中的抗癌效果 abstract: 神經膠原致癌基因 (HER2/neu) 的穿膜醣蛋白產物分子量約為185仟道爾吞，因此 HER2/neu 也稱為 p185HER2/neu。p185HER2/neu 蛋白屬於上皮生長因子受體 (EGFR) 家族的其中一員，其過度表現常與許多癌症發生有關。黃芩素 (baicalein) 為傳統中草藥上應用廣泛的黃芩根部中一種類黃酮素物質，根據已發表的研究文獻指出，黃芩素可當作抗氧化及抗發炎試劑。此外，黃芩素也有抗癌的效果，但是黃芩素在 p185HER2/neu 過度表現細胞中的抗癌分子機轉值得進一步去探討研究。本論文研究結果顯示，黃芩素可抑制神經膠原致癌基因的表現。此外也深入探討黃芩素在p185HER2/neu 過度表現的 SKOV-3 卵巢癌細胞及中的抗癌效果。實驗結果指出黃芩素在 p185HER2/neu 過度表現的細胞中可以抑制經由神經膠原致癌基因所誘發的轉形能力 (transforming ability)。
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嗜熱菌酵素中金屬離子的調控及其生物催化作用

Sun, 10 Jan 2010 18:31:32 GMT

title: 嗜熱菌酵素中金屬離子的調控及其生物催化作用 abstract: 生物催化是未來在資源使用及環境保護上的重要課題之一。一般化學反應常需高溫條件，酵素的使用雖然可以改變其反應性及產率，但也常因溫度影響而失去活性。本論文是利用高溫菌的特性，使其產生不同性質的金屬酵素，以改善在高溫中對化學反應的催化活性。在台灣特有種嗜熱菌Meiothermus taiwanensis NTU30的培養基中，改變金屬離子成份，Mn(II)、Zn(II)、B(III)、Cu(II)、Mo(VI)及Co(II)，發現僅一種或缺少單一種金屬離子時，對其生長速率影響不大，但所誘導出之蛋白質，經由SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE）的分析結果，卻明顯地具有不同消長的差異性。經破菌、硫酸銨沈澱及透析後所得之整體蛋白質，先行測試磷酸根水解的催化反應（dephosphorylation）。根據紫外光-可見光分子吸收光譜及高效率液相層析資料顯示，M. taiwanensis NTU30整體蛋白質於60℃下仍具有催化磷酸根水解反應的活性。然而在相同條件下，Escherichia coli的整體蛋白質則因高溫變性而無法進行水解作用。更有趣的是，當缺乏Cu(II)、Mo(VI)及Co(II)這些金屬離子時，則此高溫催化水解反應即無法進行。本實驗結果顯示，由嗜熱菌所分離出之酵素在高溫下仍能維持催化活性，而金屬離子則扮演了嗜熱菌蛋白質催化反應成敗的重要角色。本論文的研究結果，不但提供了新的耐高溫金屬酵素的製備觀念，對未來發展耐高溫的生物催化劑也具有相當重要的指標意義。
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利用蛋白質體學研究含吡咯環抗生素之抑菌作用

Sun, 10 Jan 2010 18:31:28 GMT

title: 利用蛋白質體學研究含吡咯環抗生素之抑菌作用 abstract: 蛋白質體學是二十一世紀對新藥開發的重要利器。利用蛋白質體學技術標的出受抗生素影響而發生變化的蛋白質，能提供較完整的藥物以及其生物活性之間關係。本論文利用兩種已知與DNA小溝鍵結之抗生素，紡錘菌素(netropsin)與偏端黴素(distamycin)進行測試。前者在結構上少一個甲基吡咯基團，但多一個正電荷的胍基。紡錘菌素對d(GGTATACC)2鍵結能力為1×105 M-1，是偏端黴素的0.5倍。但在本實驗中，發現紡錘菌素抑制大腸桿菌BL21生長能力較強，所需的濃度低於偏端黴素八倍。基於藥物與DNA作用後，會影響蛋白質生成，導致生物活性的改變。不同濃度之紡錘菌素（7, 11, 15 µM）及偏端黴素（60, 90, 120 µM），對細菌進行培養17小時後，經破菌，丙酮或硫酸銨沈澱後進行透析，得到總體蛋白質，再經一維的等電聚焦電泳，及二維聚丙醯凝膠分離後，比對蛋白質之間的差異。再利用基質輔助雷射質譜儀鑑定出蛋白質之分子量，即可找出所對應的可能代謝途徑。為了解抗生素對蛋白質生成的調控影響，在不同時間下(3，5，8，17小時)，亦分別對總體蛋白質變化進行分析。結果發現：紡錘菌素和偏端黴素在DNA雖有相似的影響，但因結構的差異性，導致所表現出的蛋白質不同，而改變細菌成長活性。因此本論文研究結果，對藥物的結構及生物活性之間的相對關係，將提供一個展新的思考方向。
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兩型斑馬魚肌肉調控蛋白MRF4a與MRF4b羧端功能區之結構分析

Sun, 10 Jan 2010 18:31:25 GMT

title: 兩型斑馬魚肌肉調控蛋白MRF4a與MRF4b羧端功能區之結構分析 abstract: MRF4是肌肉特異性轉錄因子之一，參與肌肉芽細胞的分化及增生。先前的研究發現斑馬魚MRF4基因有不同的兩型，即MRF4a與MRF4b，而且與其他物種的肌肉轉錄因子群（MRFs）的三位成員–Myf5、MyoD及Myogenin一樣，在蛋白質結構上具有一共同的保守區域bHLH domain；近年來有研究發現另一個具功能性的蛋白序列其位於bHLH domain之後，經電腦預測為一α-helix的結構，特此命名為「Helix 3 domain」，且證實此段被預測為螺旋結構的蛋白序列於骨骼肌生成上，具有促進內生性肌肉專一性調控基因的轉錄。由於MRFs家族的羧端內「Helix 3 domain」序列具高度保留性，因此本研究選擇在斑馬魚MRFb的羧端內「Helix 3 domain」（胺基酸序列210至224）以site-directed mutagenesis PCR製造MRF4b胺基酸序列219位置Serine點突變成Proline，來測定「Helix 3 domain」突變對於二級結構所造成的影響；同時也利用酵母菌單雜合分析（yeast one-hybrid system）試圖探討「Helix 3 domain」在MRFs家族的轉錄活性上，所扮演的角色。首先利用E.coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL 菌株製造MRF4a羧端蛋白、MRF4b羧端突變與未突變的重組蛋白，由圓二色旋光儀（circular dichroism）的光譜分析其二級結構，結果指出此蛋白功能區存在有「β-sheet」。此外，酵母菌單雜合分析試驗中觀測宿主酵母菌GAL1-HIS3報導基因的表現情形，也發現以MRF4b全長蛋白為activation domain之報導基因，宿主酵母菌生長情況較好；故推論具有「Helix 3 domain」的MRF4b蛋白活性較高。
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啤酒酵母菌疑似甲基轉移酶YHR209Wp之體外活性研究

Sun, 10 Jan 2010 18:31:22 GMT

title: 啤酒酵母菌疑似甲基轉移酶YHR209Wp之體外活性研究 abstract: 自人類及多種生物的基因體被解碼後，生命科學界立即邁向後基因體時代，而基因功能及蛋白質體學成為研究重點。學者們常有機會因為由某個生物體的genome之序列中找到的功能未知基因而需要面對必須找出該基因所轉譯出的蛋白質之生物學功能的挑戰。找出新基因產物之功能的方法就如同是去了解生命系統的組成。啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）中的 YHR209W 基因又被稱為 CRG1，被認為是參與調節抵抗斑蝥素（cantharidin）的相關作用的基因。由於 YHR209W 也具有甲基轉移酶之特徵序列，而 YHR209W 基因所轉譯出的蛋白質經由蛋白質序列比對（Blast-P）發現與許多甲基轉移酶較為相似且具有形成與S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosyl-L-methionine，AdoMet；簡稱為SAM）結合之三級結構部位的序列，因此 YHR209Wp 被推測為可能具有甲基轉移酶之活性。在本研究中為了探討 YHR209W 是否具有甲基轉移酶之活性以及探討其可能的受質，我們將啤酒酵母菌中的 YHR209W 基因構築到大腸桿菌（Escherichia coli; E. coli ) 之中使其表現出重組蛋白 YHR209Wp ，再以已剔除 YHR209W 基因的啤酒酵母菌 lysate為受質，利用具有放射線性質的 S-腺苷甲硫胺酸作為輔基質來測定重組蛋白 YHR209Wp 之活性。
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Chryseobacterium taeanense TKU001發酵綠豆所生產澱粉酶及其生物活性物質之研究

Sun, 10 Jan 2010 18:31:20 GMT

title: Chryseobacterium taeanense TKU001發酵綠豆所生產澱粉酶及其生物活性物質之研究 abstract: Chryseobacterium 又稱Flavobacterium，為非發酵、無運動性之菌株，係屬革蘭氏陰性桿菌。C. taeanense TKU001 以綠豆為主要碳氮源，經發酵後可生產澱粉酶，並進一步探討其酵素純化及定性。澱粉酶之較適培養條件為1.5％綠豆粉（mung bean powder；MBP）、0.1％ K2HPO4 及0.05％ MgSO4．7H2O 之100 mL 液態培養基(pH 9)，於30℃振盪(150 rpm)培養5 天後可得較佳澱粉酶活性。將發酵上清液經由冷凍乾燥（或減壓濃縮）、DEAE Sepharose CL-6B、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow 等一系列管柱層析後進行生化性質分析。最適反應溫度與熱安定性分別為50℃與<60℃，最適反應pH 與pH 安定性分別為pH 9 與pH 7-11。在化學試劑穩定性測試中，Ca2+與Tween 40 可明顯提升酵素活性，但Fe2+、Cu2+及Mn2+則會完全抑制其活性。抗氧化分析方面，以DPPH 自由基清除力、亞鐵離子螯合力、及還原力三種方式檢測，並測定其總酚含量。自由基清除試驗可達79%以上之有效清除率(1st 天)，亞鐵離子螯合力則為0.34 mg/mL EDTA equivalents (6th 天)，其總酚含量達0.38 mg/mL (7th 天)，其還原力相當於0.36 mg/mL cysteine equivalents (7th 天)。
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Bacillus cereus TKU006所生產幾丁質分解酵素及其他抗氧化物質之研究

Sun, 10 Jan 2010 18:31:16 GMT

title: Bacillus cereus TKU006所生產幾丁質分解酵素及其他抗氧化物質之研究 abstract: 本研究係探討Bacillus cereus TKU006所生產幾丁質分解酵素及其他抗氧化質之研究，探討其較適培養條件，進行酵素純化與定性為研究目的。 TKU006以1％烏賊軟骨粉末為碳/氮源培養於100 mL含 0.1％ K2HPO4及0.05％ MgSO4．7H2O之液態培養基，於25℃搖瓶培養三天可得較高幾丁聚醣酶活性；以2％蝦頭粉末為碳/氮源於25 mL液態培養基培養二天得較高幾丁質酶活性。所得發酵上清液經硫酸銨沉澱、陰離子交換層析、膠體過濾層析步驟純化得幾丁質酶、幾丁聚醣酶。幾丁質酶分子量為39 kDa，Fe2+完全抑制酵素活性，最適反應溫度、pH分別為60℃、pH 5，熱安定性、pH安定性分別為≦50℃、pH 2-8。幾丁聚醣酶分子量為44 kDa，受到Fe2+、Cu2+完全抑制酵素活性，最適反應溫度與pH分別為60℃與pH 7，熱安定性、pH安定性分別為≦50℃與pH 3-10。以25 mL含1％烏賊軟骨、0.1％ K2HPO4及 0.05％ MgSO4．7H2O之液態培養基，於25℃搖瓶培養二天，可得較佳DPPH自由基清除能力。發酵上清液之自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力、還原力分別為75％、97％與441 μg/mL CE，而酚類化合物含量為815 μg/mL GAE。總酚類化合物與自由基清除能力之相關係數為r=0.92。
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Serratia ureilytica TKU013以烏賊軟骨為唯一碳/氮源發酵生產抗氧化物之研究

Sun, 10 Jan 2010 18:31:11 GMT

title: Serratia ureilytica TKU013以烏賊軟骨為唯一碳/氮源發酵生產抗氧化物之研究 abstract: 本研究係探討Serratia ureilytica TKU013發酵幾丁質類物質生產抗氧化物質之研究。以烏賊軟骨粉(SPP)、蝦頭粉(SHP)、蟹殼(CSP)粉當作碳/氮源，依不同比例(0.5 %~2 %)之添加濃度，於25℃培養0~4天，發現以1.5 %烏賊軟骨粉培養4天所得發酵上清液之抗DPPH活性最高。乙酸乙酯層粗萃取物具有較高的DPPH清除率(ED50值為8.56 ug/mL)。經矽膠管柱層析分離出8個分液，自第4個分液進一步分離出1個命名為Serranticin的抗氧化化合物。濃度200 ug/mL的Serranticin對DPPH的清除率達到98 %。在生物活性方面，Serranticin具細胞毒殺之效果，對MCF-7 (Human breast adenocarcinoma)及WiDr(Human colon adenocarcinoma)的ED50分別為14.7 ug/mL及6.52 ug/mL。此外，亦探討發酵烏賊軟骨粉、蝦頭粉、蟹殼粉所得上清液之總酚含量、還原力、亞鐵離子螯合力。
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新型神經嵴細胞標記,capsulin,參與斑馬魚顏面發育之分子機轉探討

Sun, 10 Jan 2010 18:31:08 GMT

title: 新型神經嵴細胞標記,capsulin,參與斑馬魚顏面發育之分子機轉探討 abstract: Capsulin是一種具有basic helix I-loop-helix II(bHLH)結構之轉錄因子,其在胚胎發育早期的功能，尤其是在肌肉發育過程中的角色與定位，仍然所知有限。為了深入研究capsulin如何參與頭部肌肉的發育，我們選用斑馬魚為材料，首先，透過反轉錄-聚合酶鏈鎖反應複殖出斑馬魚capsulin之cDNA序列,並透過5’端及3’端的放大技術，利用專一性引子的作用，進而取得可轉譯出176個胺基酸的capsulin序列。經比對後得知,斑馬魚之capsulin與人類、牛、雞、小鼠、大鼠與蟾蜍分別有75%、75%、73%、76%、75%與71%之相似度。接著進行原位雜交，發現在受精後24小時的胚胎中capsulin mRNA 會表現在背側頭部後方近與卵黃交接處呈現四個點狀區塊。隨後capsulin mRNA會開始分成兩排，呈V字型往頭部延伸表現直到受精後三天左右就只剩在心臟部位有微弱的capsulin訊號表現。我們也使用胚胎抑制劑(morpholino)去抑制內生性capsulin的蛋白質轉譯，加上F59肌肉抗體染色後，發現在1.5 ng /embryo之注射劑量下，斑馬魚頭部肌肉完全消失的比率為52.9±3.69%。因此我們認為斑馬魚頭部肌肉的發育需要capsulin，沒有capsulin，頭部肌肉無法發育。為了更進一步瞭解capsulin參與頭部肌肉形成的分子機制，我們選用注射胚胎發育抑制劑加上原位雜交法來進行實驗。結果發現，capsulin訊號表現位置與dlx2的訊號表現位置相同，再藉由胚胎發育抑制劑的作用發現，若內生性Capsulin的蛋白質轉譯受阻，不管是dlx2(所有神經嵴細胞的標記) 或 sox9a(軟骨專一性神經嵴細胞標記)的mRNA表現偵測上，訊號表現皆有減弱，尤其在第三群神經嵴細胞(即將形成斑馬魚branchial arch)的訊息表現受到抑制較為明顯，於是得知了capsulin為一新型斑馬魚神經嵴細胞標記。TUNEL分析法的證據顯示，抑制capsulin的表現會導致神經嵴細胞的死亡。因此推測,顱神經嵴細胞的特化及形成斑馬魚頭部肌肉需要capsulin。此外我們也發現抑制住myf5或myoD之蛋白質轉譯，其capsulin mRNA的表現情形並無顯著變化。反之，若先抑制住capsulin，結果發現當在受精後24小時與30小時,myf5的mRNA在craniofacial muscles、pectoral fin muscles與hypaxial muscles的precursor cell上的表現受到抑制，而myoD則是在受精後36小時之前其在將形成斑馬魚頭部肌肉細胞的訊息表現也同樣的受到影響，並且也發現抑制capsulin蛋白質轉譯後，如果再外加myf5、myoD、myf5與myoD之mRNA共同注射後，頭部肌肉消失之比例降低。因此,認為capsulin在myf5及myoD的上游控制斑馬魚頭部肌肉表現。綜合以上的實驗,我們推測capsulin與斑馬魚神經嵴細胞特化及形成斑馬魚頭部肌肉的發育有關,且在斑馬魚頭部肌肉的調控生成上與MRFs之間有著密切的關聯性。
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Serratia marcescens TKU011發酵烏賊軟骨於生物活性物質生產之應用

Sun, 10 Jan 2010 18:31:04 GMT

title: Serratia marcescens TKU011發酵烏賊軟骨於生物活性物質生產之應用 abstract: Serratia marcescens TKU011係一株以蝦頭殼粉末作為唯一碳/氮源之蛋白酶及幾丁聚醣酶生產菌。本研究發現以烏賊軟骨粉末(SPP)作為碳/氮源時，TKU011生產蛋白酶及幾丁聚醣酶之較適條件為1%烏賊軟骨粉末、0.1% K2HPO4及0.05% MgSO4．7H2O，在25℃、pH 7之100 mL液態培養基振盪培養5天。延長培養基滅菌時間(在121℃下滅菌120分鐘)可得較佳之蛋白酶及幾丁聚醣酶活性。在培養基之不同滅菌時間條件下，所得發酵上清液經SDS-PAGE分析發現，酵素濃度隨滅菌時間延長而增加。自發酵物回收之烏賊粉末乾重，會隨著培養天數增加而逐漸減少，上清液可測得含有胜肽、寡糖。發酵上清液經清除DPPH自由基能力、還原力、螯合亞鐵離子能力及總酚量等測定抗氧化能力試驗，TKU011發酵SPP可生產抗氧化物質，這些抗氧化物質可能為胜肽、幾丁質及幾丁聚醣等化合物。將較適培養條件下發酵所得上清液經硫酸銨沉澱、DEAE-Sepharose及Phenyl Sepharose等層析步驟，可純化出二種幾丁質酶/幾丁聚醣酶(C1及C2)，經SDS-PAGE測得分子量分別為49 kDa及66 kDa，將進一步探討酵素生化特性分析及基質特異性。
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LMBRD1參與斑馬魚肌肉發育之分子機轉探討

Sun, 10 Jan 2010 18:31:00 GMT

title: LMBRD1參與斑馬魚肌肉發育之分子機轉探討 abstract: LMBRD1蛋白質具有467個胺基酸（約53kDa），經由序列分析，其第4至13個胺基酸可能會與肌動蛋白結合，而第193至209個胺基酸可能為核位訊號（nuclear localization signal; NLS）。由小鼠的實驗研究結果得知此LMBRD1蛋白質在老鼠實驗方面最主要作用於神經系統的海馬迴(Hippocampus)。LMBRD1缺失之小鼠，其後肢微跛，推測其肌肉發育可能受影響。為了深入研究LMBRD1如何在胚胎發育早期參與肌肉的發育，我們選用斑馬魚為材料，首先，利用野生種(WT)斑馬魚分別對各時期之胚胎執行原位雜交實驗，加以探討LMBRD1與斑馬魚早期胚胎肌肉發育時期之間的相互關係，研究結果得知其signal表現皆在頭部、嗅球、體節與肌肉，但是在脊索並無任何訊息表現。為了更近一步確認LMBRD1蛋白質表現位為肌肉組織，所以藉著LMBRD1執行抗體染色，觀察結果等同於原位雜交實驗結果。緊接著為了更加暸解NESI在斑馬魚之作用機轉，我們利用Knockdown LMBRD1方式，可觀察得到斑馬魚胚胎頭部萎縮以及魚體軀幹彎曲，緊接著再利用F59、phalloidin、α-actin、α-actinin、Dystrophinu一系列之肌肉與細胞骨架之標記抗體並染色觀察之，發現斑馬魚肌纖維排列混亂、崩解，肌動蛋白排列不規則，體節間隔板排列彎曲，肌束與肌束間隔變寬，嚴重者甚至可能造成運動神經軸索無法正常延伸發育以及心肌細胞呈現較為細長，未折疊完全之情形出現。經由F59抗體標記染色後再冷凍切片觀察得知其LMBRD1-MO之慢肌較WT排列不規則，慢肌數量上也有減少之趨勢；快肌則表現量也較少。由此，我們認為這新穎的LMBRD1蛋白質對斑馬魚胚胎在早期肌肉發育的形成與心臟發育具有關鍵性的角色。
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以基因轉殖法研究單取代釕錯合物對整體蛋白質表現的影響

Sun, 10 Jan 2010 18:30:55 GMT

title: 以基因轉殖法研究單取代釕錯合物對整體蛋白質表現的影響 abstract: 以釕金屬錯合物作為抗癌藥物的相關研究，已成為近來熱門的研究方向。由文獻中證實，此類型錯合物對於大腸桿菌亦具有抑制效果，因此本實驗利用單一取代釕錯合物可鍵結 DNA之特性，以基因轉殖法研究釕錯合物鍵結BL21( DE3 )質體DNA對整體蛋白質表現影響，初步以[Ru(tpy)(bpy)Cl]Cl作為反應物(tpy=2,2'',2"-terpyridine; bpy=2,2''-bipyridyl)。利用限制酵素切割質體DNA使形狀由超螺旋狀轉變為直線狀，而導致電泳速率下降的特性，以Pvu Ⅱ限制酵素與BL21(DE3)之萃取質體作用，選出其中分子大小為3500 bp之質體 DNA作為與釕錯合物鍵結之反應物，並且以凝膠位移法證實釕錯合物與質體DNA的加成，加成物的電泳速率隨釕錯合物濃度增加而呈現階梯狀的降緩趨勢，此情形持續到釕錯合物濃度為10 μM才停止。Ru-DNA加成物以電穿孔基因轉殖方法送入 BL21(DE3)。由於所選用菌種原已具備了Amp r與lac-Z基因所限制，導致無法以藍白菌篩選後，由定序其質體DNA方法鑑定轉殖成敗，故以1.5 %洋菜膠電泳法觀測轉殖前後之核酸變化作為鑑定轉殖的方式。分子大小為14 kb之核酸產物會在 Ru-DNA作用下產生，而不含釕錯合物者則無。轉殖後所表現之整體蛋白質以超音波震盪法破菌取出，以SDS-PAGE進行比對。釕錯合物濃度由0 μM 增加至0.1 μM會導致蛋白質總表現量增加，然而當Ru錯合物濃度再增加至1,10 μM時，蛋白質總表現量反而下降。個別蛋白質差異則以28 kDa與40 kDa兩處蛋白質最為明顯。
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Synthetic lethal screening for YJR129c gene of saccharomyces cerevisiae

Sun, 10 Jan 2010 18:30:51 GMT

title: Synthetic lethal screening for YJR129c gene of saccharomyces cerevisiae abstract: 蛋白質的甲基化是一種常見的轉譯後修飾，雖然截至目前已發現許多甲基酶以及被甲基化的位置，但仍有許多的甲基酶以及其作用位置仍未被找出。啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）中的YJR129c目前僅推測其可能是依賴S-腺核苷甲硫胺酸的甲基轉移酶，經由綠螢光蛋白可得知它存在於細胞質中，但其作用目標與相關機轉皆不知道。為了研究YJR129c與其他基因之間的關聯性，本實驗選擇了合成致死篩選法（Synthetic lethal screening）來觀察基因層面的關聯性，以推測YJR129c的功能。此方法是藉由剔除YJR129c這非必須基因，並藉由隨機突變來觀察，哪些基因在YJR129c不存在時參與了補足它的功能，這些經由篩選得到的結果，將有助於推測YJR129c的真正功能，以及其在功能路徑裡所扮演的角色。
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酵母菌IDS2基因在大腸桿菌中的蛋白質表現和純化以及甲基化活性

Sun, 10 Jan 2010 18:30:47 GMT

title: 酵母菌IDS2基因在大腸桿菌中的蛋白質表現和純化以及甲基化活性 abstract: 蛋白質會由許多種方式來修飾，其中一種為蛋白質的甲基化，而形成蛋白質甲基化的酵素為甲基轉移酶，甲基轉移酶是將S-adenosylmethionine (S-腺甲硫氨酸)所提供的甲基轉移到蛋白質上。蛋白質的甲基化作用是一種轉譯後修飾常發生於polypeptide chain，它會調節生物的生理作用，包括DNA、RNA的代謝、蛋白質的生合成及訊息傳導。 Ime2p是只在啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）進行減數分裂時才會表現的protein kinase，而Ime2p會刺激早期、中期、晚期的減數分裂基因的表現，IDS2則是刺激Ime2p作用的基因,兩者之間在功能上相互影響。而根據以往文獻的報導，IDS2p具有甲基轉移酶之特徵序列。我們將啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）IDS2基因建構到大腸桿菌的Rosseta 菌株中作蛋白質表現，利用His-tag融合純化出所需要的IDS2p，並及將△IDS2菌株之蛋白質抽取液作受質，加入氚化甲基S-腺苷甲硫氨酸[C3H3]S-adenosy-L-methionine一起進行甲基化反應，接著將受質蛋白質加以分離。將受質蛋白質以直立式凝膠電泳isoelectric focusing (IEF)進行第一維的分離,然後將分離的受質蛋白質取下進行SDS-PAGE的第二維電泳，最後我們將分離出的受質蛋白質取下進行質譜儀的鑑定分析。
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